Zusammenfassung

Enzyme sind Biokatalysatoren, die aus lebenden Organismen isoliert und in industriellen Prozessen eingesetzt werden können. Mikroorganismen, die unter extremen Lebensbedingungen wachsen können, sind als Quelle für neue Enzyme für die industrielle Biotechnologie von hohem Interesse. Diese Enzyme finden in einer Vielzahl von biotechnologischen Prozessen ihre Anwendung, z.B. in der Stärke modifizierenden, Waschmittel-, Textil-, Zellstoff und Papier- oder der Backwaren-Industrie, sowie in der Herstellung von Biodiesel, Ethanol und Tierfutter. Enzyme, die in diesen Prozessen eingesetzt werden umfassen die Enzymklassen Hydrolasen (z.B. Amylasen), Lyasen (z.B.Pectin Lyasen) und Oxidoreduktasen (z.B. Peroxidasen).
Das Screening nach neuen Enzymen ist in der vorliegenden Arbeit an marinen bakteriellen Isolaten durchgeführt worden. Dreihundert Isolate wurden in Vorarbeiten aus Tiefseeschwämmen vom Norwegischen Schelf isoliert und für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Ein Stamm zeigte im Screening herausragendes Potential als Enzymproduzent und wurde einer genaueren Analyse unterzogen. Der Stamm P203 wurde physiologisch charakterisiert, phylogenetisch klassifiziert und als neue Spezies der Gattung Bacillus beschrieben. Bacillus sp. P203 gehört zur alkaliphilen rRNA Gruppe 6 und zeichnete sich durch das Wachstum bei 4 bis 30°C, 0 bis 12% NaCl und bei pH 7 bis pH 10 als psychrotoleranter, moderat halophiler und alkalitoleranter Organismus aus, der perfekt an die marine Umgebung angepasst ist. Zusätzlich wurde der phylogenetische Nachbar des Stammes P203, Bacillus sp. LMG21005, ein bisher unbeschriebener Stamm taxonomisch eingeordnet. Bacillus sp. LMG21005 war nicht halotolerant; Wachstum konnte nur bis max. 4% NaCl beobachtet werden. Die Ergebnisse der DNA-DNA Hybridisierung zeigten, dass Bacillus sp. P203 und Bacillus sp. LMG21005 nur 32.5% Ähnlichkeit aufwiesen. Ein Vergleich der Fettsäurenzusammensetzung, des G+C Gehaltes und ausgewählter biochemischer Parameter unterstrichen die Klassifizierung von Bacillus sp. P203 und Bacillus sp. LMG21005 als zwei neue Spezies, für die die Namen Bacillus plakortiensis und Bacillus greeniensis vorgeschlagen werden.
Das Genom des marinen Bacillus sp. P203 wurde mit einem von der Firma Novozymes A/S, Kopenhagen, entwickelten Verfahren nach extrazellulären Enzymen durchsucht. In das Kulturmedium sekretierte Proteine haben den ungemeinen Vorteil, leichter aus dem Kulturüberstand gereinigt werden zu können. Expressionsmethoden, bei denen die gewünschten Enzyme in dieser Art erhalten werden, sind in der industriellen Enzym und Proteinchemie von sehr großer Bedeutung. Das am Bacillus sp. P203 durchgeführte Genomscreening lieferte insgesamt über 1000 DNA Sequenzen, die Gene enthielten, die für ein oder mehrere putativ extrazelluläre Enzyme kodierten. Die DNA Sequenzen wurden mit bioinformatischen Methoden analysiert und in Proteinsequenzen übersetzt. In den fünfzig Proteinsequenzen konnten insgesamt zwölf industriell relevante Enzyme identifiziert werden. Diese waren eine Arabinogalactosidase, eine Xylosidase, eine Xylanase, zwei Carboanhydrasen, eine Rhamnogalacturonan Lyase, zwei β-Glucosidasen, eine β-Galactosidase, zwei Proteasen und eine Peptidase. Der überwiegende Teil der neu entdeckten DNA bzw. Proteinsequenzen hatte nur eine geringe Sequenzähnlichkeit zu bereits bekannten Polypeptiden anderer Prokaryonten (ca. 40-70% Aminosäureidentität). Ein Vergleich der neuen Proteinsequenzen mit Genomsequenzen von sechs phylogenetisch benachbarten Bacillus Stämmen zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu den industriell genutzten Bacillus Stämmen B. clausii (durchschnittlich 52% Proteinsequenzähnlichkeit), B. licheniformis (43%), B. halodurans (48%) und B. subtilis (42%). Die Sekretionswege der ca. 50 neuentdeckten Proteinsequenzen von Bacillus sp. P203 wurden bioinformatisch vorhergesagt. Zwanzig Proteine wurden dem Sec Sekretionsweg zugeordnet, drei Proteine waren vermutlich TAT-abhängig. Vierzehn Protein Sequenzen hatten ein Lipobox Motiv. Aufgrund ihrer industriellen Relevanz, ihrer Aminosäureidentität zu bereits bekannten Proteinen anderer Organismen und aufgrund der Vorhersage des Sekretionswegs wurden zwei Gene für weitere Klonierungs- und Expressionsversuche ausgewählt.
Eine α-Carboanhydrase (EC 4.2.1.1) aus Bacillus sp. P203 wurde kloniert (Gen caaP203) und heterolog in Escherichia coli und einem industriellen Produktionsstamm (Bacillus subtilis TH1, Novozymes Kopenhagen) überexprimiert. In E. coli wurde die Carboanhydrase ins Periplasma sekretiert. Im B. subtilis erfolgte die Sekretion ins Kulturmedium. Der Reinigung zur Homogenität mittels hochspezifischer Affinitätschromatographie folgte die Charakterisierung des Enzyms. Carboanhydrase CaaP203 katalysierte die reversible Umsetzung von CO² zu HCO³ bei 4°C und war bis 30°C stabil. Inhibierungsstudien zeigten einen I 50 Wert von 500 μM für Azidionen und 0.09 μMfür den spezifischen Carboanhydrase Inhibitor Azetazolamid. Desweiteren konnte Esteraseaktivität von CaaP203 nachgewiesen werden. Carboanhydrasen finden Anwendung als Wirkstoffziel in der Entwicklung neuer Carboanhydrase Inhibitoren zur Behandlung von Glaukomen (grüner Star), Epilepsie, Höhenkrankeit und Krebs. In Flugzeugkabinen und in der Raumfahrt werden sie in Membranreaktoren zur Entfernung von CO² aus der Atemluft eingesetzt. CaaP203 ist die erste beschriebene Carboanhydrase einer Bacillus Art.
Ein weiteres Enzym aus Bacillus sp. P203 wurde ebenfalls in E. coli und B. subtilis TH1 kloniert und heterolog überexprimiert. Bei der Expression der Arabinogalactan endo-β-1,4-Galactosidase AgP203 in B. subtilis TH1 konnte die enzymatische Aktivität im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Im Falle von E. coli lag das rekombinante Protein zellgebunden vor. Das Aktivitätsprofil des rekombinanten Proteins war dem des Wildtypenzyms sehr ähnlich. Maximale Aktivität wurde bei pH 7 und 40°C detektiert. Arabinogalactosidasen (EC 3.2.1.89) finden Anwendung in der Futtermittelherstellung, da die Enzyme in der Lage sind, Zuckerseitenketten von Pflanzenzellwand-Polymeren abzuspalten und somit die Verdaubarkeit von pflanzlichem Futter zu erhöhen.
Die durchgeführten Arbeiten am Stamm P203 verdeutlichen das enorme Potential mariner, alkaliphiler Mikroorganismen in der industriellen Enzymproduktion.

Summary

Microorganisms that are adapted to extreme environments are sources for enzymes which are highly interesting for a variety of biotechnological processes. These enzymes can be utilized in a broad range of industrial applications for the starch, biofuel, brewing, baking or beverage industries. Enzymes from extremophiles are also attractive for the textile, detergent, pulp and paper and animal feed industries where process conditions of extreme pH-Values, high salt or solvent concentrations or high and low temperatures are required. The industrial enzymes used so far comprise the classes of hydrolases, lyases, oxidoreductases and transferases such as amylases, glucosidases, proteases, lipases, xylanases, pullulanases, phytases, mannanases, cellulases, pectate lyases and peroxidases.
In a large screening programme more than 300 marine, sponge associated isolates were selected for their ability to produce extracellular enzymes. The majority of the marine strains showed protease and amylase activities. A number of carbohydrate modifying enzyme producers were also identified (37 strains in total). One strain, isolate P203, was chosen for further studies. The marine strain P203 isolated from Plakortis simplex sponge was identified as a facultative halo- and alkalitolerant Bacillus species belonging to the alkaliphilic Bacillus RNA group 6. 16S rDNA sequence comparison revealed 98% nucleotide identity to Bacillus gibsonii DSM8722T and 99% nt identity to an up to now undescribed strain, Bacillus sp. LMG21005. The Gram-­positive strain P203 was described along with hisphylogenetic neighbor, terrestrial strain B. sp. LMG21005, as two novel species of the genus Bacillus. Growth at low temperatures (from 4 to 30°C) and at pH values from 7 to 10 and the high salt tolerance (NaCl concentrations up to 12%) underlined the adaptation of Bacillus sp. P203 to its marine environment. In contrast, strain B. sp. LMG21005 was not halotolerant (growth in the presence of up to 4% NaCl was observed) and DNA-DNA hybridization revealed only 32.5% similarity to Bacillus sp. P203. The G+C content was 41.1% and 39.6% for B. sp. P203 and B. sp. LMG21005, respectively. Comparative analysis of fatty acids and biochemical properties of B. sp. P203 and B. sp. LMG21005 with related strains supported the proposal of two novel species, namely Bacillus plakortiensis and Bacillus greeniensis.
In order to screen Bacillus sp. P203 for novel extracellular enzymes of industrial relevance, a genomic plasmid library of the strain was prepared. A rapid screening method was applied where the library was treated with a genomic marker. The "tagged" plasmids of the library were screened for genes coding for extra-cytosolic proteins. Plasmid inserts of more than five hundred selected library colonies were sequenced using primer extension in both directions originating from the transposon insertion site. During the screening programme approximately 8% of the total genome of Bacillus sp. P203 was sequenced. This is in accordance with the assumption that 10% of an average Bacillus genome encodes for extracellular proteins. The resulting 427 DNA sequence fragments contained approximately three hundred protein coding regions. The novel protein sequences from Bacillus sp. P203 belong to protein families ranging from carbohydrate modifying enzymes and proteases to ABC transporters and other cell wall (attached) proteins or proteins of yet unknown function. The majority of the novel proteins had only 40-70% amino acid identity to known proteins from other organisms. Signal peptide sequence prediction and analysis of the secretion mechanism were performed on all identified peptide sequences. The majority of the proteins (20) were predicted to be transported via the Sec-type secretion system; only three proteins were predicted to be secreted by the TAT translocation machinery. Fourteen protein sequences had a lipobox motif. The putative function of the novel genes and their deduced proteins from Bacillus sp. P203 was predicted by comparative analysis using publicly available protein and genome sequences of five related strains. The mean amino acid identities to Bacillus sp. P203 were: B. clausii (52%), B. licheniformis (43%), B. halodurans(48%), B. subtilis (42%) and Oceanobacillus iheyensis (44%)
More than fifty putative protein sequences were annotated of which twelve enzymes were potential candidates for industrial applications. The novel enzymes were an arabinogalactan endo-β-1,4-galactosidase, a xylosidase, a xylanase, two carbonic anhydrases, a rhamnogalacturonan lyase, two %beta;-glucosidases, a β-galactosidase, two proteases and one peptidase. All newly identified proteins from Bacillus sp. P203 had relatively low amino acid sequence similarity to known proteins from other microorganisms. Thus, these proteins might inherit new enzymatic properties which will broaden the diversity of industrially relevant enzymes.
Additionally, comparison of all identified coding regions from Bacillus sp. P203 to genome sequences of the five Bacillus strains mentioned above, showed a close relationship within the genera. Several genes of Bacillus sp. P203 had high similarity to genes of the two alkaliphiles Oceanobacillus iheyensis and Bacillus halodurans. The orthologs are believed to play a role in salt tolerance and alkaliphily of the strains and thus underline the role of cell wall associated proteins in the adaptationmechanisms of alkaliphiles. The results shed light on the enzyme diversity in marine environment. The secretome, i.e. the part of the genome that codes for extracellular and cell wall associated proteins, of an unknown organism was analyzed without the need to sequence the whole genome.
Two novel extracellular enzymes from Bacillus sp. P203 were cloned and their genes expressed in E. coli and B. subtilis. A putatively extracellular carbonic anhydrase (CaaP203) was classified aseukaryotic (α-type) carbonic anhydrase (EC 4.2.1.1). Carbonic anhydrases are zinc metallo-enzymes which catalyze the interconversion of CO² and HCO³. The amino acid sequence of a second identified carbonic anhydrase from B. sp. P203 showed also eukaryotic character. The presence of two α-type carbonic anhydrases encoding genes in a Bacillus strain was not described before. Gene caaP203 was integrated into the genome of a B. subtilis strain which was used to express recombinant CaaP203. Recombinant CaaP203 was secreted into the culture medium, while plasmid mediated expression in E. coli lead to translocation of the mature protein into the periplasm. CaaP203 from both expression systems was purified to homogeneity by using highly specific affinity chromatography. The protein expressed in B. subtilis had a slightly smaller protein size (26 kDa) than calculated from the gene sequence (28 kDa). The amino-terminus of the protein was found to be truncated by 19 amino acids. In addition to carbonic anhydrase activity, CaaP203 showed also esterase activity. CaaP203 was active at 4°C, stable up to 30°C and was inhibited by azide ions and specific carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide (I 50 values were 500 μM and 0.09 μM for azide and acetazolamide, respectively). Up to now, CaaP203 is the first described carbonic anhydrase from a Bacillus species.
Another enzyme from Bacillus sp. P203, arabinogalactan endo-β-1,4-galactosidase AgP203, was identified, cloned and heterologously expressed in E. coli and B. subtilis. Arabinan and arabinogalactan build the side chains of rhamnogalacturonan I which is present in a wide range of plant cell walls. Arabinogalactosidases (EC 3.2.1.89) can degrade these side chains. As a result, the enzyme improves the digestability of plant material in animal feed. Protein AgP203 was secreted into the culture supernatant when expressed in B. subtilis. Maximum activity of the cell free culture supernatant was observed at 40°C and pH 7. Culture supernatants of the wild type Bacillus sp. P203 showed a similar activity profile.
This work demonstrates the enormous potential of marine, alkaliphilic microorganisms, especially of the genus Bacillus, for the use in the field of industrial (white) biotechnology.